Diệt khuẩn bằng tia cực tím 222nm hiệu quả cao nhưng vẫn an toàn cho con người vàđộng vật có vú

Trong nhiều nghiên cứu trước đây, các nhà khoa học chỉ ra rằng, ánh sáng cực tím bước sóng 270nm có tính kháng khuẩn tương tự như tia UV có bước sóng 254nm nhưng chúng không gây tổn thương da cho động vật có vú. Mới đây, các nhà nghiên cứu đã mở rộng phạm vi nghiên cứu, tiến hành với các luồng ánh sáng tia cực tím có bước sóng 222nm và kiểm tra giả thuyết rằng có một nửa số bước sóng hẹp trong vùng UVC gần trong khoảng từ 200 – 222 nm có hại đáng kể đối với vi khuẩn nhưng không hề làm tổn hại cho các tế bào trong mô. Nghiên cứu được thực hiện dựa trên thiết bị đèn chiếu sáng kryptn-clo (Kr-Cl) tạo ra tia UV 222nm với bộ lọc để loại bỏ các thành phần tạo bước sóng ngắn và xa hơn. Trong thí nghiệm, các thông số liên quan như: Tỉ lệ vi khuẩn bị tiêu diệt, tỉ lệ các DNA bị tổn thương, sự tổn thương tế bào trên động vật có vú được nhà nghiêm cứu ghi lại đầy đủ. Ngoài ra, kết quả diệt khuẩn bằng tia UV bước sóng 222 nm cũng được so sánh với kết quả thực hiện bởi tia UV 254nm cho thấy, ánh sáng 222nm giết chết vi khuẩn Staphylococcus aureus (MRSA) một cách hiệu quả nhưng chúng không làm tổn thương DNA trên tế bào da người, trên động vật có vú giống như tia 254nm.

Giới thiệu

Việc sử dụng ánh sáng cực tím (UV) để làm bất hoạt vi khuẩn và virus đã được ứng dụng trong thực tế từ nhiều năm trước đây tuy nhiên, bức xạ tia cực tím bước sóng 254nm có mối nguy hại đến sức khỏe của con người, dễ gây ung thư da và đục thủy tinh thể.
Trước thực trạng đó, các nhà khoa học không ngừng nghiên cứu và đưa một giải pháp mới để diệt khuẩn mà không gây hại cho tế bào người. Đó chính là việc sử dụng ánh sáng UVC trong phạm vi bước sóng từ 200 đến 222nm. Nhiều nghiên cứu thực tế đã chỉ ra rằng, ánh sáng tia UV hoạt động trong phạm vi bước sóng này đủ khả năng để loại bỏ các vi khuẩn có kích thước nhỏ hơn nhiều lần so với tế bào người (đường kính của vi khuẩn <1 μm; đường kính của các tế bào người điển hình nằm trong khoảng từ 10 đến 25 μm), chúng được hấp thụ mạnh mẽ bởi các tế bào protein trong tế bào chất trên cơ thể người và bị suy giảm nghiêm trọng trước khi tiếp cận đến nhân tế bào người. Theo đó, ánh sáng UVC không thể xuyên qua lớp sừng của da và đến các tế bào cơ bản quan trọng hoặc tế bào melanocytes.
Một cơ quan khác cũng khá nhạy cảm với tia cực tím đó là giác mạc. Tuy nhiên, với ánh sáng UVC 220nm thì việc xuyên gia giác mạc và làm ảnh hưởng đến cơ quan mắt đó là điều tương đối khó.
Việc sử dụng ánh sáng UVC cho mục đích khử trùng ngay cả khi có sự xuất hiện của con người đã mở ra hướng đi mới trong nhiều lĩnh vực của khoa học và đời sống, điển hình là việc khử trùng vết mổ (SSI). Nếu vết mổ không được khử trùng sạch, chúng sẽ dẫn đến nhiều hệ lụy, làm nhiễm trùng vết thương, khiến cơ thể suy kiệt, gây tổn thất chi phí y tế. Để giải quyết vấn đề, đèn excimer đã được vận dụng để sản sinh tia UV bước sóng ngắn. Mặc dù có giá thành tương đối rẻ nhưng đèn ánh sáng phát ra từ đèn excimer đã góp phần tích cực vào việc diệt khuẩn trong không gian.
Trước đây, ánh sáng tia UV bước sóng 207nm được phát ra từ chất kích thích krypton – bromine (Kr-Br) có hiệu quả diệt khuẩn nên chúng được ứng dụng trong việc chữa lành vết thương phẫu thuật. Nếu UVC được chứng minh là an toàn cho mắt và da dù chiếu sáng liên tục, không cần sử dụng đồ bảo hộ thì việc khử trùng trong phòng phẫu thuật trở nên đơn giản hơn.
Trong thí nghiệm của mình, nhóm nghiên cứu mở rộng phạm vi đối với ánh sáng Krypton –clo (Kr-Cl) tạo ra áng sáng cực tím đơn sắc với bước sóng 222nm và xác định rằng ánh sáng nằm trong khoảng bước sóng từ 200 đến 222nm làm bất hoạt vi khuẩn hiệu quả nhưng không gây độc tế bào hoặc làm đột biến các tế bào trên động vật có vú.
Kết luận được đưa ra dựa trên phép đo về tỷ lệ sống sót của vi khuẩn MRSA và các tổn thương DNA tiền ung thư điển hình sau khi tiếp xúc với các luồng ánh sáng có bước sóng 222nm khác nhau. Một thử nghiệm khác cũng đã được tiến hành trên 8 điểm cuối tế bào và phân tử có liên quan đến tổn thương da ở chuột không lông. Với thời gian tiếp xúc 48h với ánh sáng UV bước sóng 222nm và 254nm, tỷ lệ SSI được đánh giá là giảm đáng kể. Kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với giả thuyết về việc UV 222nm có khả năng diệt khuẩn tương tự UV 254nm nhưng UV 222nm an toàn hơn đối với con người và động vật có vú.

Phương pháp tiến hành thí nghiệm

Đèn UV

Đèn excimer hoạt động dựa trên hỗn hợp khí krypton-clo có khả năng phát ra tia UV bước sóng 222nm, làm mát bằng không khí với cửa sổ thoát 6000 mm2. Một bộ lọc thông dải tùy chỉnh được sử dụng để loại bỏ các tạp chất xung quanh.
Máy quang phổ UV có độ nhạy trong phạm vi bước sóng từ 200 đến 360nm được sử dụng để mô tả quang phổ bước sóng phát ra từ đèn excimer. Đèn deuterium với bức xạ quang phổ có thể theo dõi NIST (Newport Corp, Stratford, CT) được sử dụng để hiệu chỉnh phổ kế UV.
Các nghiên cứu cũng được thực hiện với đèn diệt khuẩn thủy ngân với mức phát xạ cực đại ở bước sóng 254nm được sử dụng để đối chứng. Một bộ cảm biến ILT1400 được trang bị đầu dò SEL220 với nhiệm vụ đo tốc độ lưu loát từ cả hai đèn. Đối với phơi nhiễm cấp tính (MRSA và mô 3D), đèn 222nm và 254nm được đặt tương ứng ở khoảng cách 9cm và 99cm, từ mẫu tương ứng với mật độ công suất 0,036 mJ/cm2. Đối với phơi nhiễm mãn tính ở chuột, việc cung cấp 157 mJ/cm2 trong khoảng thời gian 7 giờ được bởi các ánh sáng của đèn bước sóng 222- 254nm cách các mẫu các khoảng tương ứng là 41cm và 205 cm; mật độ năng lượng tương ứng là 0,0062 mJ/cm2 đối với đèn 222nm và 0,0008 mJ/cm2 trong trường hợp đèn diệt khuẩn thông thường.
Hình 1 thể hiện quang phổ đo được phát ra từ đèn kích thích Kr-Cl, cùng với phát xạ kích thích chính ở 222nm, bao gồm các tần số thấp hơn của ánh sáng bước sóng cao hơn (tức là ~ 237 và ~ 258nm). Để loại bỏ những bước sóng cao hơn thâm nhập làm tăng khả năng gây hại cho tế bào người, nhóm nghiên cứu đã sử dụng bộ lọc thông dải tùy chỉnh (Omega Quang, Brattleboro, VT), đèn chỉ phát ra bước sóng đơn ở 222nm.

Hình 1: Phổ phát xạ đo được khi ánh sáng từ đèn excimer không phát và phát tia UV 222 nm

Khả năng tiêu diệt tế bào MRSA

Nhà nghiên cứu đã sử dụng S.aureus kháng methicillin (MRSA) – nguyên nhân chính gây ra bệnh truyền nhiễm trong cồng đồng để thực hiện thí nghiệm. Sự sống sót của MRSA được đánh giá ngay sau khi quá trình tia UVC kết thúc nhằm đưa ra hiệu quả diệt khuẩn của UVC một cách chính xác nhất.

Các tổn thương DNA Premutagenic sau khi chiếu tia UVC trong mô hình da người 3D

Mô hình da người 3D EpiDerm-FT (MatTek Corp, Ashland, MA) được sử dụng để làm thí nghiệm. Mô hình có cấu tạo da tương tự như da người với lớp sừng và các lớp tế bào bên trong để tái tạo lớp biểu bì và hạ bì của con người. Nhóm nghiên cứu đã đo được cảm ứng của hai tổn thương DNA tiền ung thư phổ biến nhất ở lớp biểu bì, cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) và pyrimidine-pyrimidone 6-4 photop sau khi tiếp xúc với UVC bằng cách sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch.

Thử nghiệm trên chuột

Chuột không lông đực sáu đến tám tuần tuổi được đưa vào trong thí nghiệm. Loài chuột này có phổ tác động UV đối với các thay đổi mô học, vật lý và có thể nhìn thấy tương tự như da người. Bên cạnh đó, lớp sừng của chuột SKH1 tương đối dày (5 – 10 μm) tương đương với da người.
Một nhóm gồm ba con chuột đã bị phơi nhiễm với 157 mJ/cm 2 từ ánh sáng 222nm trong thời gian 7 giờ bởi một đèn exciter Kr-Cl trong khi một nhóm ba con chuột khác bị chiếu xạ mà không có tia UV. Chuột tiếp xúc với 157 mJ / cm 2 được phân phối trong khoảng thời gian 7 giờ từ ánh sáng 254nm đại diện cho nhóm đối chứng.
Tất cả các thủ tục trên động vật được thực hiện theo các hướng dẫn và quy trình của liên bang được chấp thuận bởi Trung tâm Y tế Đại học Columbia IACUC

Sau 48 giờ tiếp xúc với tia cực tím, nhóm nghiên cứu đã đo các chỉ số sau:
– Độ dày biểu bì được đo trong các mẫu nhuộm hematoxylin và eosin
– Tỷ lệ keratinocytes tăng sinh biểu hiện kháng nguyên Ki-67
– Năng suất của các chất điều chỉnh pyrimidine pyrimidine gây ra bởi tia cực tím (CPD) và 6-4 tế bào quang (6-4PP)
– Số lượng bạch cầu trung tính và tế bào mast là dấu hiệu của viêm da
– Biểu hiện của keratin (K) K6A là dấu hiệu phân biệt da
Các mô được kiểm tra với kính hiển vi Olympus IX70 được trang bị máy ảnh kỹ thuật số có độ phân giải cao, hiệu quả cao của Photometrics PVCAM; Phần mềm Image-Pro Plus 6.0 và phần mềm Fiji / Image J đã được sử dụng để phân tích hình ảnh. Đối với mỗi con chuột, mỗi điểm đo trong ít nhất sáu trường quan sát được chọn ngẫu nhiên.

Phân tích thống kê

Các giá trị trung bình giữa các nhóm thực nghiệm được so sánh, đánh giá với các tiêu chuẩn để đưa ra kết quả chính xác nhất.

Kết quả thực nghiệm

Độ sống sót của MRSA

Tỷ lệ sống của MRSA được đo ngay sau khi tiếp xúc với các luồng ánh sáng 222nm khác nhau được tạo ra bởi đèn chiếu sáng Kr-Cl. Kết quả được thể hiện trong hình 2 cho thấy sự sống sót của MRSA khi tiếp xúc với các dòng tương tự từ đèn UV 222 nm tương tự như việc tiếp xúc với UV 254nm.

Hình 2:Tế bào vi khuẩn bị tiêu diệt bởi ánh sáng tia cực tím bước sóng 222nm và 254 nm

Mức độ gây tổn thương DNA tiền ung thư ở da người

Hình 3 đưa ra kết quả thấy sự so sánh giữa tính nhạy cảm của CPD (bảng bên trái) và 6-4PP (bảng phải) trong các mô da 3D khi tiếp xúc với ánh sáng 222nm hoặc 254nm. Không giống như ánh sáng diệt khuẩn thông thường (254nm), việc tiếp xúc với ánh sáng 222nm ở mọi lưu lượng đều không làm tổn thương cho da người.

Hình 3: So sánh mưc độ tác động của UV 222nm và UV 254nm lên da người

Độ dày biểu bì và tăng sinh Keratinocyte

48 giờ sau khi tiếp xúc, các phần da trên cơ thể chuột được đưa ra so sánh. Kết quả cho thấy, giống như ánh sáng 254nm, độ dày biểu bì của da chuột tiếp xúc với đèn exciter 222nm không khác biệt nhiều so với da của chuột không phơi sáng (P = 0,18)

Hình 4: Độ dày biểu bì và tăng sinh Keratinocyte ở da chuột sau khi tiếp xúc với ánh sáng UVC

• Bảng A: Hình cắt ngang của da lưng chuột nhuộm H&E so sánh độ dày biểu bì ở chuột khi tiếp xúc với sham (bảng trên cùng), sau khi tiếp xúc với 157 mJ/cm2 từ UV 254nm (bảng giữa) và với UV 222nm (bảng dưới cùng).
• Bảng B định lượng độ dày biểu bì.
• Bảng C: Các tế bào Keratinocytes Ki-67 dương tính trong các mặt cắt ngang điển hình trên da cuột bị phơi nhiễm (bảng trên cùng), sau khi tiếp xúc với UV 254 nm (bảng giữa) và sau khi tiếp xúc với UV 222nm (bảng dưới cùng).
• Bảng D: Định lượng tỉ lệ Keratinocytes biểu hiện kháng nguyên Ki-67. Các giá trị đại diện cho mức độ trung bình ±SD của độ dày biểu bì được đo trong 9 trường chọn ngẫu nhiên (n=3)

Từ hình 4, có thể thấy, Ki-67 trong tế bào keratinocytes của da tiếp xúc với đèn excimer 222nm không khác biệt về mặt thống kê so với đối chứng (P = 0,52). Ngược lại, đèn diệt khuẩn 254nm đã tăng sinh tế bào keratinocytes (tăng gấp 2,5 lần so với đối chứng, P <0,0001).

Các tổn thương DNA khi tác động bởi UV

Hình 5 hiển thị hình ảnh cắt ngang của chuột bị chiếu xạ hoặc da chuột tiếp xúc với 157 mJ/cm2 từ ánh sáng 222nm hoặc ánh sáng 254nm, so sánh các tổn thương da tiền ung thư CPD (Hình 5A, bảng trên cùng) và 6-4PP (Hình 5A, bảng dưới cùng). Kết quả đạt được tương tự với những nghiên cứu trước đó khi việc tiếp xúc vớ đèn diệt khuẩn thông thường (254nm) gây ra sự gia tăng đáng kể các tổn thương trên da.

Hình 5: Các tổn thương DNA tiền ung thư do UVC gây ra ở chuột:

• Hình A: Hình ảnh cắt ngang mẫu da lưng so sáng các tổn thương da tiền ung thư CPD (hàng trên cùng, tế bào nhuộm màu tối) và 6-4PP (hàng dưới cùng, tế bào nhuộm màu tối) trong lớp biểu bi của chuột bị phơi nhiễm (cột bên trái) của những con chuột tiếp xúc với 157 mJ/cm2 từ ánh sáng 254 nm (cột giữa) hoặc ánh sáng 222nm (cột bên phải).
• Định lượng tỉ lệ keratinocytes hiển thị CPD (bảng B)
• Bảng C hiển thị 6-4PP điều chỉnh độ sáng
• Giá trị đại diện cho mức trung bình ±SD của các ô hiển thị các đô mở được đo trong 9 trường quan sát chọn ngẫu nhiên trên mỗi con chuột (n=3)

Viêm da

Để đánh giá tình trạng viêm tế bào do tia cực tím gây ra, nhóm nghiên cứu đã đo mật độ của các tế bào mast và các bạch cầu trung tính [nghĩa là các tế bào giả định myeloperoxidase (MPO)] (Hình 6). Mặc dù ánh sáng 254nm gây ra sự gia tăng đáng kể về mặt thống kê của cả hai điểm đánh dấu (P <0,0005) (Hình 6, Bảng 1) nhưng mật độ của tế bào mast và bạch cầu trung tính gây ra bởi ánh sáng 222nm (Hình 6, bảng B) không được phân biệt thống kê với các điều khiển ( P = 0,68 và P = 0,59).

Hình 6: Viêm da do UVC gây ra ở chuột.

Mật độ của tế bào mast (bảng A) và tế bào (bảng B) biểu hiện enzyme myeloperoxidase (MPO) (bạch cầu trung tính) trong lớp biểu bì của chuột khi tiếp xúc với sham, của chuột khi tiếp xúc với ánh sáng 157 mJ/cm2 từ ánh sáng 254 nm hoặc 222 nm được đo trong 6 trường quan sát chọn ngẫu nhiên trên mỗi con chuột (n=3).

Sự khác biệt trên da

Sự biệt hóa tế bào keratin ở da chuột tiếp xúc với ánh sáng 222nm đã đưa đưa ra và so sánh với kết quả tiếp xúc với sham và với ánh sáng 254nm. Hình 7 minh họa hình ảnh cắt ngang của chuột bị phơi nhiễm (bảng trên cùng), da chuột tiếp xúc với 157 mJ/cm2 từ ánh sáng 254nm (bảng giữa) hoặc từ ánh sáng 222nm (bảng điều khiển phía dưới). Mức độ biểu hiện của K6A ở vùng da tiếp xúc 222nm không khác biệt về mặt thống kê so với nhóm chứng (P = 0,22) (bảng 1). Điều này trái ngược với sự gia tăng ~ 3 lần của K6A mới được tổng hợp trong các mẫu tiếp xúc với ánh sáng từ đèn diệt khuẩn thông thường (P <0,0001).

Hình 7: Phân biệt mô ở da chuột sau khi tiếp xúc với UVC. Hình ảnh cắt ngang đại diện của biểu bì lửng chuột biểu hiện K6A (khu vực nhuộm màu nâu) với định lượng tương đối

Kết luận

Ánh sáng UV bước sóng 222nm về cơ bản là hiệu quả tương đương trong việc tiêu diệt vi khuẩn tương tự như UV 254nm. Tuy nhiên, ánh sáng 222nm không gây ra các tổn thương DNA tiền ung thư điển hình liên quan đến tia cực tím ở tế bào keratinocytes ở mô hình da người 3D và an toàn cho da của những con chuột không có lông.
Trong khi ánh sáng ở vùng 200-222nm có thể truyền qua các vi khuẩn có kích thước siêu nhỏ (<1 μm) nhưng không thể xâm nhập tế bào động vật có vú tế bào cũng như tất cả các mô có lớp sừng.
Ứng dụng hàng đầu của tia UVC bước sóng 222 nm đó là làm giảm nhiễm trùng trong phẫu thuật – SSI. Ánh sáng tia cực tím xa trong phạm vi 200- 222nm có thể được sử dụng để khử trùng các vết thương trong quá trình làm phẫu thuật nhằm vô hiệu hóa vi khuẩn trước khi chúng xâm nhập vào phần bên trong vết thương. Ánh sáng tia cực tím gần không thể đi qua các mô với lớp sừng như da và thấu kính của mắt. Do đó, khi sử dụng ánh sáng này không cần trang bị thêm quần áo bảo hộ cho bệnh nhân hoặc nhân viên y tế. Ngoài ra, việc ngăn chặn vi khuẩn xâm nhập vào vết thương sẽ giảm thiểu nguy cơ hình thành các cụm vi khuẩn hoặc màng sinh học.
Các ứng dụng tiềm năng khác của ánh sáng UVC bước sóng ngắn là khử trùng môi trường nào có khả năng lây truyền mầm bệnh trong không khí cao, bao gồm bệnh lao, thủy đậu, SARS và cúm – những căn bệnh làm ảnh hưởng đến sức khỏe của một tỷ người mỗi năm. Mặc dù các hệ thống chiếu xạ UV từ lâu đã được xem xét để khử trùng phòng nhưng chúng không thể được sử dụng rộng rãi do lo ngại về sự an toàn liên quan đến ung thư da và nguy cơ đục thủy tinh thể nhưng sự xuất hiện của UVC đã thay đổi toàn bộ những lo lắng này, hứa hẹn sẽ là một phương thức an toàn và rẻ tiền, ứng dụng rộng rãi trong đời sống.